Die Anwendung der Echtzeit-RT-PCR in Covid-19

Was ist Echtzeit-RT-PCR?

Das Hinzufügen fluoreszierender Gene zum PCR-Reaktionssystem, die Verwendung der Fluoreszenzsignalakkumulation zur Überwachung des gesamten PCR-Prozesses in Echtzeit und die anschließende Quantifizierung des unbekannten Templates über eine Standardkurve wird als quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie bezeichnet, die auch als Echtzeit-Q bezeichnet wird -PCR.

Das Prinzip der PCR-Amplifikation ist das gleiche wie das eines gewöhnlichen PCR-Instruments, außer dass die während der PCR-Amplifikation zugesetzten Primer mit Isotopen, Fluorescein usw. markiert sind und die Primer und fluoreszierenden Sonden verwendet werden, um spezifisch an die Matrize zur Amplifikation bei zu binden die selbe Zeit.

Die verstärkten Ergebnisse werden gesammelt und über das Echtzeitsammelsignal des Fluoreszenzsignalsammelsystems an das Computeranalyse- und -verarbeitungssystem übertragen, um eine quantitative Echtzeitergebnisausgabe zu erhalten.

Echtzeit-RT-PCR ist eine der am häufigsten verwendeten Labormethoden zum Nachweis des COVID-19-Virus. Während viele Länder Echtzeit-RT-PCR zur Diagnose anderer Krankheiten wie Ebola-Virus und Zika-Virus verwendet haben, benötigen viele Unterstützung bei der Anpassung dieser Methode an das COVID-19-Virus sowie bei der Erhöhung ihrer nationalen Testkapazitäten.

Wie funktioniert Echtzeit-RT-PCR mit dem COVID-19-Virus?

Eine Probe wird aus den Körperteilen entnommen, in denen sich das COVID-19-Virus ansammelt, z. B. Nase oder Rachen einer Person. Die Probe wird mit mehreren chemischen Lösungen behandelt, die Substanzen wie Proteine ​​und Fette entfernen und nur die in der Probe vorhandene RNA extrahieren. Diese extrahierte RNA ist eine Mischung aus dem eigenen genetischen Material der Person und, falls vorhanden, der RNA des Virus.

Die RNA wird unter Verwendung eines spezifischen Enzyms revers in DNA transkribiert. Die Wissenschaftler fügen dann zusätzliche kurze DNA-Fragmente hinzu, die zu bestimmten Teilen der transkribierten viralen DNA komplementär sind. Wenn das Virus in einer Probe vorhanden ist, binden sich diese Fragmente an Zielabschnitte der viralen DNA. Einige der hinzugefügten genetischen Fragmente werden zum Aufbau von DNA-Strängen während der Amplifikation verwendet, während die anderen zum Aufbau der DNA und zum Hinzufügen von Markierungsmarkierungen zu den Strängen verwendet werden, die dann zum Nachweis des Virus verwendet werden.

Die Mischung wird dann in ein RT-PCR-Gerät gegeben. Die Maschine durchläuft Temperaturen, die das Gemisch erwärmen und abkühlen, um bestimmte chemische Reaktionen auszulösen, die neue, identische Kopien der Zielabschnitte der viralen DNA erzeugen. Der Zyklus wird immer wieder wiederholt, um die Zielabschnitte der viralen DNA weiter zu kopieren. Jeder Zyklus verdoppelt die vorherige Anzahl: Aus zwei Kopien werden vier, aus vier Kopien werden acht und so weiter. Ein Standard-Echtzeit-RT-PCR-Aufbau durchläuft normalerweise 35 Zyklen, was bedeutet, dass am Ende des Prozesses aus jedem in der Probe vorhandenen Virusstrang etwa 35 Milliarden neue Kopien der Abschnitte viraler DNA erstellt werden .

Während neue Kopien der viralen DNA-Schnitte erstellt werden, haften die Markierungsmarkierungen an den DNA-Strängen und setzen dann einen fluoreszierenden Farbstoff frei, der vom Computer der Maschine gemessen und in Echtzeit auf dem Bildschirm angezeigt wird. Der Computer verfolgt die Fluoreszenzmenge in der Probe nach jedem Zyklus. Wenn ein bestimmtes Fluoreszenzniveau überschritten wird, bestätigt dies, dass das Virus vorhanden ist. Wissenschaftler überwachen auch, wie viele Zyklen erforderlich sind, um dieses Niveau zu erreichen, um die Schwere der Infektion abzuschätzen: Je weniger Zyklen, desto schwerer ist die Virusinfektion.

Warum Echtzeit-RT-PCR verwenden?

Die Echtzeit-RT-PCR-Technik ist hochempfindlich und spezifisch und kann eine zuverlässige Diagnose in nur drei Stunden liefern, obwohl Laboratorien durchschnittlich zwischen sechs und acht Stunden benötigen. Im Vergleich zu anderen verfügbaren Virusisolierungsmethoden ist die Echtzeit-RT-PCR erheblich schneller und weist ein geringeres Kontaminations- oder Fehlerpotential auf, da der gesamte Prozess in einem geschlossenen Röhrchen durchgeführt werden kann. Es ist weiterhin die genaueste verfügbare Methode zum Nachweis des COVID-19-Virus.

Echtzeit-RT-PCR kann jedoch nicht zum Nachweis früherer Infektionen verwendet werden, was für das Verständnis der Entwicklung und Ausbreitung des Virus wichtig ist, da Viren nur für ein bestimmtes Zeitfenster im Körper vorhanden sind. Andere Methoden sind erforderlich, um frühere Infektionen zu erkennen, zu verfolgen und zu untersuchen, insbesondere solche, die sich möglicherweise ohne Symptome entwickelt und verbreitet haben.